Consignes

Complétez ce document en remplissant les chunks vides pour écrire le code qui vous a permis de répondre à la question. Les réponses attendant un résultat chiffré ou une explication devront être insérés entre le balises html code. Par exemple pour répondre à la question suivante :

La bioinfo c'est : <code>MERVEILLEUX</code>.

N’hésitez pas à commenter votre code, enrichier le rapport en y insérant des résultats ou des graphiques/images pour expliquer votre démarche. N’oubliez pas les bonnes pratiques pour une recherche reproductible ! Nous souhaitons à minima que l’analyse soit reproductible sur le cluster de l’IFB.

Introduction

Vous allez travailler sur des données de reséquençage d’un génome bactérien : Bacillus subtilis. Les données sont issues de cet article :

Complete Genome Sequences of 13 Bacillus subtilis Soil Isolates for Studying Secondary Metabolite Diversity

Analyses

Organisation de votre espace de travail

## Repertoire de travail
pwd
#/shared/projects/dubii2021/agodmer

## Enregistrement de l'arborescence dans le fichier Evaluation_M4_M5/supplemental_data/Organisation_espace_de_travail.txt
tree > supplemental_data/Organisation_espace_de_travail.txt

## Commande tree
tree

#[agodmer@clust-slurm-client Evaluation_M4_M5]$ tree
#.
#|-- DATA_analysis
#|   |-- CLEANING
#|   |-- FASTQ
#|   |-- MAPPING
#|   |-- QC
#|   `-- REFERENCE_GENOME
#|-- EvaluationM4M5-main-results
#|   |-- Evaluation.Rmd
#|   |-- Evaluation.html
#|   |-- EvaluationM4M5.Rproj
#|   |-- README.md
#|   |-- css
#|   |   `-- style.css
#|   |-- images
#|   |   |-- inrae.png
#|   |   `-- migale-orange.png
#|   `-- resources
#|       |-- biblio.bib
#|       |-- biomed-central.csl
#|       `-- footer.html
#|-- LICENSE
#|-- README.md
#`-- supplemental_data
#    |-- Organisation_espace_de_travail.txt
#    `-- README_supp_data.md

 
## Il n'y a pas de modification à faire pour l'instant

Téléchargement des données brutes

Récupérez les fichiers FASTQ issus du run SRR10390685 grâce à l’outil sra-tools [1]

## Répertoire de travail
pwd
#/shared/projects/dubii2021/agodmer/Evaluation_M4_M5/EvaluationM4M5-main-results

## Charger le module SRA tools avec la dernière version 
module avail sra-tools
module load sra-tools/2.10.3

## Utilisation de la commande fasterq-dump pour télécharger les fichiers 

## Visualisation de la version
fasterq-dump --version
#"fasterq-dump" version 2.10.3

## Ecriture de la version de fasterq-dump sur le fichier Version_tools.txt dans supplemental_data
fasterq-dump --version > ../supplemental_data/Version_tools.txt

## Changement du répertoire de travail
cd ..

## Reservation des ressources pour le cluster
salloc --cpus-per-task=6 --mem=5G

## Télécharger les fichiers FASTQ
srun fasterq-dump --split-files -p SRR10390685 --outdir DATA_analysis/FASTQ/

## Lister les fichiers et regarder leur taille
ls -sh DATA_analysis/FASTQ/
#total 5.0G
#2.5G SRR10390685_1.fastq  2.5G SRR10390685_2.fastq

## Compression des fichier FASTQ avec mode verbeux acitvé
srun gzip --verbose DATA_analysis/FASTQ/*.fastq

# Liste des fichier et taille
ls -sh DATA_analysis/FASTQ/
#total 1.3G
#617M SRR10390685_1.fastq.gz  627M SRR10390685_2.fastq.gz

## La compression a bien fonctionnée !

Combien de reads sont présents dans les fichiers R1 et R2 ?

## Répertoire de travail
pwd
#/shared/projects/dubii2021/agodmer/Evaluation_M4_M5/DATA_analysis

## Chargement du module seqkit
module avail seqkit
module load seqkit/0.14.0
## Ecriture de la version de seqkit sur le fichier Version_tools.txt dans supplemental_data
seqkit version >> ../supplemental_data/Version_tools.txt

## Comptage des read présents et écriture des statistiques dans le fichier Raw_stats_fastq.txt dans Results/supplemental_data
srun seqkit stats --threads 1 FASTQ/*.fastq.gz > ../supplemental_data/Raw_stats_fastq.txt

## Visualisation des résultats
cat ../supplemental_data/Raw_stats_fastq.txt

#file                          format  type   num_seqs        sum_len  min_len  avg_len  max_len
#FASTQ/SRR10390685_1.fastq.gz  FASTQ   DNA   7,066,055  1,056,334,498       35    149.5      151
#FASTQ/SRR10390685_2.fastq.gz  FASTQ   DNA   7,066,055  1,062,807,718      130    150.4      151

Les fichiers FASTQ contiennent 7,066,055 reads.

Téléchargez le génome de référence de la souche ASM904v1 de Bacillus subtilis disponible à cette adresse

## Repertoire de travail
pwd
#/shared/projects/dubii2021/agodmer/Evaluation_M4_M5/DATA_analysis

## Téléchargement du génome de référence
srun wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/009/045/GCF_000009045.1_ASM904v1/GCF_000009045.1_ASM904v1_genomic.fna.gz

## Visualisation du fichier
ls -sh
#total 68K
#68K GCF_000009045.1_ASM904v1_genomic.fna.gz

Quelle est la taille de ce génome ?


## Taille du génome de référence
## Enregistrement du résultats dans Stats_genome_ref.txt
zcat GCF_000009045.1_ASM904v1_genomic.fna.gz | grep -v "^>" | tr --delete "\n" | wc -c > ../../supplemental_data/Stats_genome_ref.txt

## Visualisation du fichier
cat ../../supplemental_data/Stats_genome_ref.txt
#4215606

La taille de ce génome est de 4215606 paires de bases.

Téléchargez l’annotation de la souche ASM904v1 de Bacillus subtilis disponible à cette adresse

## Répertoire de travail
pwd
#/shared/projects/dubii2021/agodmer/Evaluation_M4_M5/DATA_analysis/REFERENCE_GENOME

## Téléchargement de l'annotation du génome
srun wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/009/045/GCF_000009045.1_ASM904v1/GCF_000009045.1_ASM904v1_genomic.gff.gz

## Visualisation des fichiers
ls -sh

#total 1.3M
#1.2M GCF_000009045.1_ASM904v1_genomic.fna.gz   69K GCF_000009045.1_ASM904v1_genomic.gff.gz

Combien de gènes sont connus pour ce génome ?

## Répertoire de travail
pwd
#/shared/projects/dubii2021/agodmer/Evaluation_M4_M5/DATA_analysis/REFERENCE_GENOME

## Enregistrement du résultats dans Stats_genome_ref_nb_genes.txt
less GCF_000009045.1_ASM904v1_genomic.gff.gz | awk '($3 == "gene")' | wc -l > ../../supplemental_data/Stats_genome_ref_nb_genes.txt

## Visualisation du fichier
cat ../../supplemental_data/Stats_genome_ref_nb_genes.txt
#4448

4448 gènes sont recensés dans le fichier d’annotation.

Contrôle qualité

Lancez l’outil fastqc [2] dédié à l’analyse de la qualité des bases issues d’un séquençage haut-débit

## Répertoire de travail
pwd
#/shared/projects/dubii2021/agodmer/Evaluation_M4_M5/DATA_analysis

module avail fastqc
module load fasqc/0.11.9
## Ecriture de la version de fastqc sur le fichier Version_tools.txt dans supplemental_data
fastqc --version >> ../supplemental_data/Version_tools.txt

## Réservation des resources pour le cluster
salloc --cpus-per-task=8 --mem=10G

## Lancement de la commande fastqc
srun fastqc FASTQ/SRR10390685_1.fastq.gz -o QC/ -t 8
srun fastqc FASTQ/SRR10390685_2.fastq.gz -o QC/ -t 8

## Copie des rapport htlm vers supplemental data
cp QC/*html ../supplemental_data/

La qualité des bases vous paraît-elle satisfaisante ? Pourquoi ?

[ ] Oui
[ ] Non

car comme le montre

Lien vers le rapport MulitQC SRR10390685_1 Lien vers le rapport MulitQC SRR10390685_2 Est-ce que les reads déposés ont subi une étape de nettoyage avant d’être déposés ? Pourquoi ?

[ ] Oui
[ ] Non

car

Quelle est la profondeur de séquençage (calculée par rapport à la taille du génome de référence) ?

La profondeur de séquençage est de : X.

Nettoyage des reads

Vous voulez maintenant nettoyer un peu vos lectures. Choisissez les paramètres de fastp [3] qui vous semblent adéquats et justifiez-les.

Les paramètres suivants ont été choisis :

Parametre	Valeur	Explication

Ces paramètres ont permis de conserver reads pairés, soit une perte de % des reads bruts.

Alignement des reads sur le génome de référence

Maintenant, vous allez aligner ces reads nettoyés sur le génome de référence à l’aide de bwa [4] et samtools [5].

Combien de reads ne sont pas mappés ?

reads ne sont pas mappés.

Croisement de données

Calculez le nombre de reads qui chevauchent avec au moins 50% de leur longueur le gène trmNF grâce à l’outil bedtools [6]:

reads chevauchent le gène d’intérêt.

Visualisation

Utilisez IGV [7] sous sa version en ligne pour visualiser les alignements sur le gène. Faites une capture d’écran du gène entier.

References

1. toolkit NS. NCBI sra toolkit. NCBI, GitHub repository. 2019.

2. Andrews S. FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/.

3. Zhou Y, Chen Y, Chen S, Gu J. Fastp: An ultra-fast all-in-one fastq preprocessor. Bioinformatics. 2018;34:i884–90. doi:10.1093/bioinformatics/bty560.

4. Li H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. arXiv preprint arXiv:13033997. 2013.

5. Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, et al. The sequence alignment/map format and samtools. Bioinformatics. 2009;25:2078–9.

6. Quinlan AR, Hall IM. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 2010;26:841–2.

7. Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative genomics viewer (igv): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 2013;14:178–92.

A work by Migale Bioinformatics Facility

https://migale.inrae.fr

Our two affiliations to cite us:

Université Paris-Saclay, INRAE, MaIAGE, 78350, Jouy-en-Josas, France

Université Paris-Saclay, INRAE, BioinfOmics, MIGALE bioinformatics facility, 78350, Jouy-en-Josas, France

Examen final Modules 4 et 5

DUBii 2021

Alexandre Godmer

08 April, 2021